Easy Taq DNA Polymerase (recombinante) – Concentração 500U (5 U/µL) – NOVA BIOTECNOLOGIA

• A enzima termoestável Taq DNA polimerase de Thermus Aquaticus é a forma recombinante da enzima expressa em Escherichia coli.
• Apresenta elevada processividade 5’→3’, e uma atividade de exonuclease 5´- 3´, porém sem atividade exonuclease 3’→ 5’.
• A Taq DNA polimerase mostra excelente atividade em pH 8,5 a 72°C, sendo estável na incubação em elevadas temperaturas (95°C).
• A enzima é constituída por uma cadeia polipeptídica simples com peso molecular de aproximadamente 94 KDa.

Unidade Enzimática:

• Uma unidade da Taq DNA Polimerase é definida como a quantidade necessária para incorporar 10nmoles de dNTPs em 30 minutos a 72°C, em condições de ensaio padrão.

Componentes:

• Enzima Taq DNA Polimerase.
• 10X Tampão de Reação (livre de íons Mg2+).
• 50mM de MgCl2.

Tampão de Armazenamento:

• 20 mM HEPES pH 7,9.
• 100 mM KCl.
• 0,1 mM EDTA.
• 0,5 mM PMSF.
• 1,0 mM DTT.
• 50% glicerol.

Tampão de Reação:

• 100 mM Tris HCl pH 8,5.
• 500 mM KCl.

Ensaios de Controle de Qualidade:

• SDS-PAGE (pureza).
• Espectrometria de massa.
• OVER-DIGESTÃO: A incubação de 5U da Taq DNA Polimerase com 1 mg de DNA, em tampão de reação próprio durante 16 horas a 72°C, fornece um padrão de fragmentos de clivagem nítido, livre de DNA de E.coli [3]

Procolo Básico de Amplificação:

• A) Utilizar microtubos estéreis de 0,2 – 0,5 mL. Os tubos devem permanecer dentro de gelo.Detalhes sobre parâmetros críticos e informações adicionais podem ser encontrados na referência [1]. Para obter um excelente rendimento na amplificação de fragmentos de DNA é aconselhável a utilização de um kit de pipetas exclusivas, ponteiras com barreira e ambiente livre de contaminação. O protocolo sugerido serve como um guia geral e ponto inicial de protocolos de amplificação de DNA.
• B) Homogeneizar a mistura, através de rápida centrifugação (Fast-spin).
• C) Incubar em termo bloco a 94°C por 3-5 min, para desnaturar o DNA.
• D) Proceder com 20 – 35 ciclos de amplificação: desnaturação a 94°C por 45 s; Anelamento a 55°C [**] por 30 s e extensão a 72°C por 1 min. Adicionalmente uma etapa de extensão a 72°C por 10 min é recomendada. Manter a 4°C até a análise.
• E) Analisar os produtos obtidos através de eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida, corando com brometo de etídeo e visualizando em luz ultravioleta.

Figura 1. A deconvolução da espectrometria de massa da Taq DNA Polimerase revela com precisão o valor da massa molecular da enzima (93.903 kDa) quando comparado com o valor teórico, baseado em dados da seqüência primária da enzima. Adicionalmente, o pico foi muito homogêneo (*) revelando o grau de pureza da preparação da enzima Taq Polimerase.