Diferença entre PCR Tempo Real e PCR Convencencial: Um Guia para Laboratórios
Ao discutir técnicas de amplificação de DNA, é comum se deparar com a PCR convencional e a PCR em tempo real (qPCR). Vamos analisar aprofundadamente as diferenças entre elas.
PCR Convencional:
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Detalhamento da Detecção: Na PCR convencional, após a amplificação, o produto é visualizado usando eletroforese em gel. Isso exige que, após realizar a PCR convencional, você proceda com a eletroforese, tingimento e visualização sob luz UV.
- Produtos Inespecíficos: A PCR convencional pode, ocasionalmente, produzir produtos inespecíficos devido à falta de monitoramento em tempo real, tornando a interpretação dos resultados mais desafiadora.
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Tempo: A PCR convencional geralmente leva mais tempo para fornecer resultados, considerando as etapas adicionais, como eletroforese em gel.
Termociclador:
O termociclador é o equipamento crucial para realizar a PCR convencional. Sua função primária é alterar rapidamente as temperaturas em ciclos específicos, permitindo assim as diferentes etapas da PCR. Vamos ver as etapas e como o termociclador se encaixa nelas:
- Desnaturação: Na primeira etapa, o termociclador aquece a mistura de PCR a uma temperatura de cerca de 94-98°C. Isso “derrete” ou denatura a dupla hélice do DNA, resultando em duas fitas simples.
- Anelamento (ou ligação): O termociclador, em seguida, reduz a temperatura para algo entre 50-65°C. Isso permite que os primers se liguem (ou anelem) às fitas simples de DNA nos locais específicos que são complementares a eles.
- Extensão: O termociclador, em seguida, aumenta a temperatura para cerca de 72°C, a temperatura ideal para a enzima Taq polimerase. Esta enzima começa a adicionar nucleotídeos complementares à fita simples de DNA, usando os primers como ponto de partida.
Estes três passos são repetidos geralmente 20-40 vezes (dependendo da necessidade), e cada ciclo resulta em um dobramento do produto de DNA. O termociclador é essencial, pois permite estas mudanças rápidas e precisas de temperatura, garantindo a eficiência da reação de PCR.
Conclusão: A PCR convencional, com a ajuda de um termociclador, revolucionou a pesquisa em biologia molecular, tornando possível amplificar milhões de cópias de uma sequência específica de DNA em apenas algumas horas.
PCR Tempo Real (qPCR):
- Monitoramento em Tempo Real: Diferentemente da PCR convencional, a qPCR monitora a amplificação em tempo real através de sondas fluorescentes ou corantes intercalantes.
- Especificidade: A qPCR, ao contrário da PCR convencional, frequentemente utiliza sondas específicas, o que aumenta a precisão e a especificidade da reação.
- Rapidez: A qPCR, em comparação com a PCR convencional, economiza tempo, pois evita etapas pós-PCR, como eletroforese em gel.
- Aplicações Diversificadas: Enquanto a PCR convencional é principalmente usada para detectar a presença de genes ou fragmentos de DNA, a qPCR tem uma gama mais ampla de aplicações.
- Menor Risco de Contaminação: Sem a necessidade de manipulação pós-amplificação, há menos risco de contaminação com a qPCR em comparação com a PCR convencional.
Resumindo:
A PCR convencional é eficaz para identificar a presença ou ausência de um gene ou fragmento de DNA. Por outro lado, a PCR em tempo real é a técnica de escolha para quantificações ou detecções mais específicas. Ambas têm seu valor em laboratórios de biologia molecular, dependendo do objetivo da pesquisa.
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